Mikroskopie živých buněk – předpoklady

Při pozorování živých buněk (live cell imaging) je třeba klást veliký důraz na redukci foto-toxických účinků světla (bleaching). Hustota výkonu osvětlení na rovině vzorku, kompatibilní se životem zkoumaných buněk, se pohybuje v rozmezí od mW/cm² (widefield fluorescenční mikroskopy) do W/cm² (konfokální mikroskopy SDCM – spinning disc confocal microscopes). Při vysoké hustotě výkonu osvětlení dochází k intenzivnímu bleachingu fluoroforů, což vytváří volné radikály a další reakční produkty, které ničí molekuly v okolí a mění prostředí vně a uvnitř buněk.

Buněčné kultury a tkáně je nutné udržovat ve fyziologických podmínkách po celou dobu experimentu. Faktory jako teplota, vlhkost, složení média a pH jsou velmi důležité pro získání smysluplných informací o zkoumaných procesech. V závislosti na původu kultivovaných buněk je třeba nastavit výše zmíněné faktory na konkrétní hodnoty a tyto hodnoty udržovat stabilní.

Video:

Mitochondrie v gliomových buňkách. iXon Ultra, 60x, NA: 1.49. Nasnímáno bylo celkem 6 478 1Mpx snímků! Voxel 0.201*0.201*0.293 um, X/Y:1024*1024 pixelů, Z:41, T:79, 2 kanály. Data byla nasnímání během krátkého (13 min) time-lapse experimentu při demonstraci systému Andor Dragonfly. Vzorky poskytla Dr. Veronika Huntošová z UPJS/CIB, Košice, Slovensko.

Esenciální vybavení pro live cell imaging mikroskop je uvedeno v tabulce:

Citlivost

• 90% kvantová účinnost u kamer iXon (EMCCD)
• 82% kvantová účinnost u kamer Zyla (sCMOS)

Kontrola prostředí

• Inkubátory od předních světových výrobců (Okolab)

Mikroskop

• Precizní XY a Z piezo motorizovaná stage
• Hardware autofocus
• Specializované objektivy

Další

• Active blanking – propojení mezi světelným zdrojem a kamerami
• Filtry – kompatibilní s požadovanými vlnovými délkami v excitační a emisní cestě

Webinář