Die FLIM-Methode (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) nutzt ein optisches Mikroskop zur Erfassung der Fluoreszenzlebensdauer. Sie gehört zu den Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, die sich dadurch auszeichnet, dass sie die Fluoreszenz zur Kontrastierung einzelner mikroskopischer Aufnahmen nutzt. Das Ergebnis ist eine sogenannte FLIM-Karte, die die räumliche Verteilung der Fluoreszenzlebensdauer für einen ausgewählten Bereich der Probe angibt. Ein FLIM-System lässt sich durch die Kombination eines optischen Mikroskops mit einem TCSPC-Lumineszenzspektrometer realisieren.
Standardkonfiguration des Systems aus Fluorimeter und Mikroskop
Breitband-Fluoreszenzbildgebung
In dieser Konfiguration wird zur Anregung der Probe eine breitbandige Xe-Lampe verwendet, die Bestandteil des Lumineszenzspektrometers ist. Zur Auswahl der gewünschten Wellenlänge dient ein Anregungsmonochromator, dessen Ausgang über einen Flüssigkeitslichtleiter oder eine optische Faser zum Mikroskop geführt wird. Der Anregungsstrahl wird im Inneren des Mikroskops von einem dichroitischen Spiegel reflektiert und in das Objektiv geleitet. Zur Aufzeichnung des Lumineszenzbildes dient eine hochempfindliche Kamera.
- Breitband-Fluoreszenzaufnahme von BPAE-Zellen (Bovine Pulmonary Artery Endothelial)
Detektion von Lumineszenzspektren
In dieser Anordnung werden sowohl der Anregungs- als auch der Emissionszweig des Spektrofluorimeters genutzt. Flüssigkeitslichtleiter (optische Fasern) sorgen für die Übertragung des Anregungssignals vom Fluorimeter zum Mikroskop und des Lumineszenzsignals vom Mikroskop zum Fluorimeter.
Erfassung der Fluoreszenz-/Phosphoreszenzlebensdauer
Zur Messung der Lumineszenzlebensdauer ist im Mikroskop eine gepulste Laserdiode integriert, die als Anregungsquelle dient. Die Ausrichtung des Laserstrahls auf die gewünschte Stelle der Probe erfolgt mithilfe einer Kamera und eines Schiebetisches. Das Lumineszenzsignal wird über einen Flüssigkeitslichtleiter (bzw. eine optische Faser) in den Emissionsarm des TCSPC-Spektrometers geleitet.
- Abklingen der DAPI-Fluoreszenz nach Bindung an die DNA, Lebensdauer bestimmt mittels der TCSPC-Technik
FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)
Ist das Mikroskop mit einem computergesteuerten mikroskopischen XYZ-Tisch ausgestattet, kann die gesamte Anordnung in der Konfiguration zur Detektion der Lumineszenzlebensdauer für FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) verwendet werden. Bei dieser Methode der Fluoreszenzbildgebung basiert der Kontrast des resultierenden Bildes auf der Lebensdauer der einzelnen Fluorophore. Die resultierende Karte gibt die räumliche Verteilung der Fluoreszenzlebensdauer für einen ausgewählten Bereich der Probe an. Zur Anregung der Lumineszenz werden neben gepulsten Laserdioden zunehmend auch superkontinuierliche Laser eingesetzt, die gepulste (Pikosekunden-)Breitbandstrahlung erzeugen. Der Anwender verfügt somit über eine wesentlich größere Flexibilität bei der Auswahl der Anregungswellenlänge.
