Die zeitkorrelierte Einzelphotonen-Zählung (TCPC = Time-Correlated Single Photon Counting) ist ein äußerst empfindliches Verfahren, mit dem sich die zeitlich aufgelöste Fluoreszenz mit einer Zeitauflösung im Bereich von Pikosekunden (ps) bis Nanosekunden (ns). Es handelt sich um eine digitale Technik, die auf dem statistischen Charakter des Ausklingens von Lumineszenzphotonen basiert.
Messprinzip
Bei der TCSPC wird die untersuchte Probe wiederholt mit einer gepulsten Lichtquelle mit hoher Wiederholungsfrequenz (im kHz- und MHz-Bereich) angeregt. Der Zeitpunkt der Emission des Anregungspulses dient als Referenzzeit. Während der Messung wird die Häufigkeit des Auftretens einzelner Photonen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Emission des Anregungspulses erfasst. Eine wichtige Voraussetzung ist, dass bei jedem Anregungsimpuls höchstens ein einziges emittiertes Photon detektiert werden kann. Der Anregungsimpuls stellt für die TCSPC-Elektronik ein START-Signal dar, während das Emissionssignal (die Registrierung des ersten emittierten Photons) die Rolle eines STOP-Signals spielt. Zudem muss die Fluoreszenzintensität sehr gering sein, damit die Ankunft einzelner Photonen registriert werden kann. Zur Detektion einzelner Photonen werden Photodetektoren mit hoher interner Verstärkung verwendet. Dabei handelt es sich vor allem um Photomultiplier (PMT), Mikrokanal-Platten-Photomultiplier (MCP-PMT) und Avalanche-Fotodioden (APD).
TCSPC-Elektronik
Die Hauptkomponenten für die Signalverarbeitung mittels der TCSPC-Methode sind der Konstantfraktionsdiskriminator (CFD = Constant Fraction Discriminator), der Zeit-zu-Spannungsamplituden-Wandler (TAC = Time-to-Amplitude Converter), ein Verstärker (zwischen TAC und ADC) sowie ein Analog-Digital-Wandler (ADC = Analogue-to-Digital Converter).
Das Ansteuersignal (START) und das Signal vom Detektor (STOP) werden an den CFD geleitet, der ein logisches Zeitsignal erzeugt, sobald der Eingangsimpuls einen bestimmten vorgegebenen Anteil seiner Amplitude erreicht. Der Zeit-Amplituden-Wandler beginnt aufgrund des zeitlichen START-Signals, eine linear mit der Zeit ansteigende Spannung zu erzeugen. Diese Spannung wird nicht mehr erzeugt, sobald der Wandler das Eintreffen des zeitlichen STOP-Signals registriert. Das Ausgangsspannungssignal TAC ist dann proportional zum Zeitintervall zwischen dem START- und dem STOP-Signal. Diese Spannung wird anschließend von einem A/D-Wandler (ADC) verarbeitet und im Speicher des Computers abgelegt. Bei einer großen Anzahl von START-STOP-Zyklen entspricht das gemessene Histogramm dem Abklingverhalten der Fluoreszenz.
Direkter vs. inverser Betriebsmodus
Bei der Verwendung von Impulsquellen mit hoher Wiederholungsfrequenz hat die oben beschriebene Messung imdirekten Modus einen deutlichen Nachteil. Zwar wird die überwiegende Mehrheit der START-STOP-Zyklen durch ein START-Signal ausgelöst, doch das STOP-Signal erreicht den TAC nicht rechtzeitig vor dem Anstieg des nächsten START-Impulses, sodass sich der TAC ständig im Reset-Modus befindet. Aus diesem Grund wird die TCSPC-Elektronik häufig so eingestellt, dass sie im sogenannten Reverse-Modus arbeitet. Der Unterschied besteht darin, dass das Emissionssignal als START-Signal für den Spannungsanstieg am TAC verwendet wird und der Anregungsimpuls hingegen als STOP-Signal dient. Die Referenzimpulse der Lichtquelle werden verzögert, damit sie später als das START-Signal am TAC ankommen.
Zeitauflösung
Die TCSPC-Methode kann die Fluoreszenzlebensdauer in einem Bereich von ~5 ps bis ~50 µs messen. Die Untergrenzeτmin (erreichbare Zeitauflösung) hängt von einer Größe ab, die als Instrumentenantwortfunktion (IRF = Instrument Response Function) bezeichnet wird. Einem idealen System mit extrem schmaler Zeitbreite der Anregungspulse, einem unendlich genauen Detektor und einer TCSPC-Elektronik ohne Jitter entspricht eine IRF in Form einer unendlich schmalen Kurve (d-Funktion). Abweichungen von diesen idealen Bedingungen führen zu einer Verbreiterung der Instrumentenantwortfunktion. Die häufigsten begrenzenden Faktoren für die erreichbare Zeitauflösung sind die Zeitbreite der Anregungsimpulse und die Fähigkeit des Detektors, den genauen Ankunftszeitpunkt einzelner Photonen zu bestimmen. Die gemessene Kinetik des Fluoreszenzabklingens ist das Ergebnis der Faltung der IRF mit der tatsächlichen Zeitantwort. Bei einer schnellen Fluoreszenzantwort ist daher eine zusätzliche mathematische Bearbeitung (Dekonvolution) der gemessenen Abklingkurve erforderlich. Die numerische Dekonvolution ermöglicht es, Lebensdauern zu unterscheiden, die etwa 10 % der Halbwertsbreite (FWHM) der Ansprechfunktion des Geräts entsprechen (siehe Faktor 1/10 im Ausdruck fürτmin im unteren Teil der Abbildung). Zur experimentellen Bestimmung der IRF wird meist eine Probe verwendet, die das Licht stark streut (die Streuung verläuft um mehrere Größenordnungen schneller als die Fluoreszenz, sodass man mit guter Näherung τ→0 annehmen kann).
Die Obergrenzeτmax wird durch die Wiederholungsfrequenz der gepulsten Anregungsquelle und die Dunkelzählrate (dark count rate) des Detektors bestimmt. Wenn das Fluoreszenzsignal nicht rechtzeitig abklingen kann, bevor ein weiterer Puls auf die Probe trifft, entsteht ein stationärer Hintergrund, wodurch der Dynamikbereich eingeschränkt wird. Wenn das Fluoreszenzsignal in der Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Anregungspulsen auf 1/10.000 seines Spitzenwerts abklingen kann, wird die längste messbare Lebensdauer auf 1/10 der Periode der Anregungsquelle geschätzt (siehe Ausdruck fürτmax im unteren Teil der Abbildung). Um einen deutlichen Rückgang der Messgenauigkeit zu vermeiden, sollte der Maximalwert der Anzahl der Dunkeldetektionen numerisch 5 % des Wertes der Wiederholungsfrequenz der Anregungsquelle entsprechen (d. h. beispielsweise sollte ein Detektor mit 50.000 cps in Kombination mit einer Lichtquelle mit einer Frequenz > 1 MHz verwendet werden).
