Spinning-Disk-Mikroskopie mit 3D-Superauflösung

Was erwarten Forscher in der Regel von den modernsten Mikroskopen für das Live-Cell-Imaging und die Bildgebung fixierter Proben? Zum Beispiel, dass sie sehr schnell und empfindlich tief in die Probe hineinbilden. Dass sie Proben unterschiedlicher Größe abbilden, von Nanometern bis zu Millimetern. Die Möglichkeit zu haben, unvorhergesehene dynamische Zellereignisse zu entdecken. Bilder mit nanometergenauer Lokalisierung und hoher Auflösung zu erhalten. Lebende Organismen mehrere Tage lang ununterbrochen abzubilden, ohne dass es zu Phototoxizität kommt. So viele verwertbare Daten wie möglich im gesamten Sichtfeld zu gewinnen.

All dies ist dank des neuen Modells des konfokalen Mikroskops Dragonfly 600 mit Dual-Spinning-Disk und Mikrolinsen der Firma ANDOR möglich. Das Dragonfly 600 liefert hervorragende mehrdimensionale Bilder, die von subzellulären Proben (im Nanometerbereich) bis hin zum gesamten Organismus (im Zentimeterbereich) reichen. Neue Superauflösungsmodule und das patentierte B-TIRF-Verfahren decken selbst kleinste Details auf, wie beispielsweise die Dynamik einer Virusinfektion oder die Ultrastruktur von Chromatin oder Organellen.

Das Dragonfly 600 verfügt über alle notwendigen Werkzeuge für die Einzelmolekül-Lokalisierung. Es nutzt ein astigmatisches 3D-Superauflösungsmodul und liefert Bilder mit einer Lokalisierungsgenauigkeit im Nanometerbereich und einer entsprechenden Auflösung von bis zu 10 nm.

Dieses neue Modell knüpft an die erfolgreiche Dragonfly-500-Serie an und konzentriert sich vor allem auf die superauflösende Lokalisierungsbildgebung mit DNA-PAINT sowie auf die hochauflösende 3D-Bildgebung von Geweben. Dank der flexiblen Skriptschnittstelle lässt sich das Dragonfly 600 zudem mit Fluidsystemen für die groß angelegte multiomische Bildgebung kombinieren.

Wo kann der Dragonfly 600 eingesetzt werden?

1. Neurowissenschaften

Forscher im Bereich der Neurowissenschaften müssen in der Regel sowohl lebende als auch fixierte Proben unterschiedlicher Größe abbilden: von Nanometern bis zu Millimetern. Mit dem Dragonfly lässt sich fast alles abbilden – Gliazellen, axonaler Transport, große Gewebeschnitte, expandierte Proben (ExM) oder Dendriten, und zwar mit Superauflösung (SMLM).

Lokalisierung synaptischer Zonen und Verständnis funktioneller Zustände mithilfe von SMLM:

• Superauflösung von Synapsen in 3D (bis zu 30 nm axial) mithilfe des Superauflösungsmoduls
• Auflösung gebundener synaptischer Vesikel mittels SMLM mit einer lateralen Auflösung von bis zu 10 nm
• Sichtbarmachung von Rezeptoren an der Membran und Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses mittels B-TIRF
• Superauflösung von Strukturen tief im Inneren von Neuronen mittels konfokaler Auflösung (Z ~10 μm)

Erstellung von Hirnatlanten mittels räumlicher Transkriptomik:

• Kartierung der Genexpression auf zellulärer Ebene
• Präzise Quantifizierung der Genexpression mithilfe der gleichmäßigen Beleuchtung von Borealis®
• Steigerung der Produktivität durch Nutzung eines großen Sichtfelds und schneller konfokaler Bildaufnahme

Abbildung lebender Neuronenproben:

• Darstellung dynamischer Vorgänge (z. B. Kalzium-Signalweg) dank schneller konfokaler Bildaufnahme mit bis zu 400 fps
• Darstellung empfindlicher Proben (z. B. Schleimhautexplantate, Hirnschnitte) durch schonende Beleuchtung
• Erfassung aller Signale durch kurze Belichtungszeiten und hochempfindliche Detektoren 

Abbildung tiefer in dichtem Hirngewebe mithilfe von NIR:

• Größere Eindringtiefe in die Probe
• Bessere Lebensfähigkeit der Probe dank geringerer Strahlungsenergie

2. Zellbiologie

Ob es um die Abbildung von Zellpopulationen, intrazellulären Organellen, Expansionsmikroskopie (ExM) oder Superauflösungsmikroskopie – beim Dragonfly 600 findet sich immer die passende Modalität für eine hochwertige Zellbildgebung: konfokale Bildgebung, B-TIRF, Widefield, SMLM oder Superauflösung, kompatibel mit der Abbildung lebender Zellen (SRRF-Stream+).

Abbildung der Ultrastruktur von Zentriolen oder 3D-Komplexen von Kernporen:

• Darstellung der Chromatinorganisation und Epigenetik mit einer Auflösung von bis zu 10 nm in XY
• Untersuchung der Struktur der Mitochondrienmembran mit einer axialen Auflösung von 30 nm mithilfe des 3D-Superauflösungsmoduls
• Visualisierung von Rezeptoren auf der Zellmembran und Identifizierung von Biomolekülen, die an der zellulären Signalübertragung beteiligt sind, mithilfe des 3D-Superauflösungsmoduls in Kombination mit HLE und B-TIRF

Darstellung der Dynamik von Zellorganellen bei minimaler Phototoxizität und minimalem Photobleaching:

• Abbildung lebender Proben über mehrere Tage hinweg dank hochempfindlicher Detektoren
• Darstellung wachsender Mikrotubuli und beweglicher Zilien mittels schneller konfokaler Bildaufnahme (400 fps)

Darstellung von Fusionsprozessen und Rezeptorsignalwegen

• Gewinnung von mehr Informationen aus einem einzigen Bild dank gleichmäßiger Ausleuchtung des gesamten Sichtfelds mittels der patentierten Borealis-Technologie
• Darstellung des vesikulären Transports mittels B-TIRF mit einer um 30 % höheren Ausleuchtungsgleichmäßigkeit als bei herkömmlichem TIRF

Zellbildgebung mittels Expansionsmikroskopie (ExM):

• Schnellere Aufnahme mehrerer Bilder dank großem Sichtfeld, hochempfindlichen Detektoren und leistungsstarken Lasern
• Quantifizierung und Interpretation von mehr Daten auf einem mikroskopischen Bild dank der gleichmäßigen Beleuchtung durch Borealis
• Gewinnung von Informationen aus mehreren Sonden durch Nutzung des breiten Anregungsspektrums von HLE

3. Krebsforschung

„Visualisierung tief im Gewebe und in sich bildenden Metastasen dank optimierter Pinhole-Durchmesser auf einer rotierenden Scheibe.“

Die Krebsforschung erfordert einen ganzheitlichen Ansatz in der Biologie, der Einblicke in die Genexpression, das Tumormikromilieu, die Malignität sowie in vitro-/in vivo-Tests erfordert. Mit dem Dragonfly 600 können Forscher die Wechselwirkungen zwischen dem Verhalten von Tumorzellen und ihrer Umgebung sowie die räumliche Verteilung des Tumors in fixierten oder lebenden Zellen beobachten.

Dank des breiten Anregungsspektrums von ILE oder HLE und der mehrfarbigen Abbildung mehrerer Signale aus Tumorerkrankungen lassen sich alle Informationen in einem einzigen Experiment erfassen. Die schonende Bildgebung liefert Live-Aufnahmen von Tumorgewebe über Stunden oder Tage hinweg. Die Bildaufnahmegeschwindigkeit und der optimierte Abstand zwischen den einzelnen Pinholes auf der Spinning-Disk ermöglichen eine tiefere Abbildung von Organoiden und dichten Geweben.

4. Entwicklungsbiologie

„Darstellung des Blutflusses oder der Bewegung von Zilien mittels konfokaler Bildgebung.“

Die Entwicklungsbiologie erfordert die Abbildung dickerer Proben. Die optimierte Größe und der optimierte Abstand der Pinholes auf der Spinnscheibe des Dragonfly-Systems ermöglichen die Abbildung dickerer Proben bis zu einer Tiefe von einem Millimeter. Dank der gleichmäßigen Ausleuchtung des gesamten Sichtfelds ohne Randvignettierung können mehrere Aufnahmen bei hoher Vergrößerung gemacht, nahtlos zu einem einzigen Bild zusammengefügt und so der gesamte Organismus in hoher Auflösung visualisiert werden. Dank der außergewöhnlichen Geschwindigkeit des Dragonfly-Systems und der hochempfindlichen Detektoren lassen sich beispielsweise die Entwicklung von Mausembryonen oder andere anspruchsvolle Prozesse über Stunden oder Tage hinweg aufzeichnen.

5. Mikrobiologie und Virologie

„Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen Wirt und Erreger mit erhöhter Gleichmäßigkeit, die das neue B-TIRF bietet.“

Mithilfe des einzigartigen B-TIRF-Moduls des Dragonfly 600 lässt sich ein Live-Einblick in die Interaktion zwischen Virus und Wirt gewinnen. Durch die Kombination eines leistungsstarken HLE-Lasermotors mit einem 3D-Superauflösungsmodul, das Daten mit einer lateralen Auflösung von bis zu 10 nm und einer axialen Auflösung von 30 nm erfasst, lassen sich Erkenntnisse über die Ultrastrukturbiologie von Pilzen, Bakterien und Viren gewinnen. Durch die Nutzung der Vorteile einer hohen Hintergrundunterdrückung und der extremen Empfindlichkeit der Detektoren lassen sich Infektionen tief im Gewebe analysieren.

6. Transkriptomik & Proteomik

„Steigerung der Produktivität bei der Gewinnung von Omik-Daten dank des leistungsstarken HLE-Laserantriebs.“

Das Verständnis der molekularen Grundlagen der Entwicklung, der Gehirnfunktionen, neurodegenerativer Erkrankungen und ihres Verhaltens ist eine gewaltige Aufgabe. Die als„-omik“bekannten Wissenschaftszweige sammeln Informationen über Xn biologische Moleküle, um die gesamte Molekülgruppe zu charakterisieren und zu quantifizieren. Das Dragonfly-System eignet sich dank seiner hochempfindlichen Detektoren, der außergewöhnlich hohen Hintergrundunterdrückung, der hohen Bildaufnahmegeschwindigkeit, der gleichmäßigen Beleuchtung und der Automatisierungsmöglichkeiten ideal für solche Anwendungen. Die Forschung in den -omik-Disziplinen findet in vielen Bereichen der Biowissenschaften Anwendung, z. B. bei der Vorhersage des Krankheitsverlaufs auf der Grundlage von Genexpressionskarten, der Untersuchung des Tumormikromilieus und der Schweregradbestimmung bei Krebserkrankungen.