PALM (PhotoActivation Localization Microscopy), auch bekannt als photoaktivierbare Lokalisationsmikroskopie, ist ein Verfahren der Lokalisationsmikroskopie, das zursuperauflösenden Abbildungvonmit Fluoreszenzsonden markiertenObjektendient. Das Prinzip von PALM basiert auf der präzisen Lokalisierung einzelner photoaktivierbarer Fluoreszenzmoleküle (in der Regel Proteine, sogenannte PAFPs = photoactivable fluorescence proteins), was zur Bildrekonstruktion führt. Diese Moleküle emittieren in Abhängigkeit von der Wellenlänge und der Intensität der Anregungsstrahlung eine große Anzahl von Photonen und sind in der Lage, bei einer Änderung der Wellenlänge den Zustand ihrer Emission so zu verändern, dass sie erlöschen oder ihre Farbe ändern (fluoreszieren). Die individuelle Abbildung fluoreszierender Moleküle im Rahmen einer zufälligen Auswahl auf der Grundlage der Fluoreszenzaktivierung ist möglich, wenn die folgende Bedingung erfüllt ist:
Die fluoreszierenden Moleküle müssen weiter voneinander entfernt sein, als es die konventionelle Auflösungsgrenze des Objektivs zulässt – das bedeutet, dass zu einem bestimmten Zeitpunkt nur ein Molekül von Dutzenden bis Hunderten von Molekülen, die sich innerhalb eines Kreises befinden, dessen Radius der konventionellen Auflösungsgrenze des Mikroskops entspricht. Um Superauflösung zu erreichen, muss daher sichergestellt werden, dass nicht zwei nahe beieinander liegende Moleküle mit überlappenden PSF (Point Spread Function = Punktstreufunktion) gleichzeitig abgebildet werden.
Durch die Erfüllung dieser Bedingung wird nach einigen Tausend bis Zehntausenden Wiederholungen die schrittweise Lokalisierung aller in der Fluoreszenzsonde vorkommenden Moleküle ermöglicht.
Die Aktivierung nur einer begrenzten Anzahl von Molekülen aus der Gesamtzahl potenzieller Fluoreszenzquellen wird durch das Umschalten der PAFPs in den Fluoreszenzzustand mithilfe von Lichtimpulsen geringer Intensität gewährleistet. Die umgeschalteten PAFPs werden anschließend bei gleichzeitiger Anregung im PSF-Integrationsmodus erfasst, und zwar so lange, bis ihre Fluoreszenz infolge von Photobleaching erlischt. Die auf diese Weise abgebauten Moleküle spielen in den nachfolgenden Photoaktivierungsprozessen keine Rolle mehr, was die Lokalisierung weiterer Moleküle der Fluoreszenzsonde bis zur Erstellung einer sehr genauen Karte der fluoreszierenden Objekte, die ein superaufgelöstes Bild der räumlichen Verteilung aller Sondenmoleküle in der Probe darstellt.
