Im Gegensatz zur Bildgebung mit der klassischen Fluoreszenzmikroskopie im Widefield-Modus wird bei der konfokalen Mikroskopie das Signal aus dem Probenbereich unterdrückt, das aus einem Bereich außerhalb der Fokusebene stammt. Dadurch lassen sich dickere Präparate unter Beibehaltung des Kontrasts und eines hohen Signal-Rausch-Verhältnisses beobachten. Aneinem Konfokalmikroskop, das mit einem Detektor oder einer Kamera sowie einer Workstation mit entsprechender Software (Imaris) ausgestattet ist, kann der Anwender dann ein dreidimensionales Modell des gesamten Präparats digital rekonstruieren (3D-Visualisierung). Es gibt zwei Hauptansätze:
- CLSM (Confocal Laser Scanning Microscopy) – Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie
- SDCM (Spinning-Disc-Konfokalmikroskopie) – Konfokalmikroskopie auf Basis einer rotierenden Scheibe
Abbildung 1: Schematische Darstellung herkömmlicher mikroskopischer Verfahren (Andor, 2016)
Ein Nachteil der laserbasierten konfokalen Rastermikroskopie ist die Fokussierung eines sehr intensiven Laserstrahls auf jeden einzelnen Bildpunkt (Pixel). Dadurch ist die Probe über einen längeren Zeitraum den toxischen Wirkungen des Lichts ausgesetzt. Zudem muss das Licht des Laserstrahls nacheinander auf alle abzubildenden Punkte treffen, was zu einer erheblichen Einschränkung der Bildaufnahmegeschwindigkeit führt, insbesondere bei hoher Auflösung (z. B. 2048 × 2048 Pixel). Die Unterdrückung des Signals aus dem Bereich außerhalb der Fokusebene erfolgt durch den Einsatz einer sogenannten „Pinhole“-Blende mit variabler Größe, die vor dem Detektor angeordnet ist.
Abbildung 2: Weitfeldmikroskopie (links), Konfokalmikroskopie (rechts). Eine optische Ebene (60× 1,2 NA). Im Weitfeldmodus aufgenommene Bilder enthalten Signale aus Bereichen außerhalb der Fokusebene. Ein auf einer rotierenden Scheibe basierendes Konfokalmikroskop liefert ein scharfes Bild aus einer Fokusebene mit mehr Details sowie höherem Kontrast und größerem Dynamikbereich. Dragonfly, Andor (Andor, 2016).
Die auf einer rotierenden Petráň/Nipkow-Scheibe (Spinning Disc) basierende konfokale Mikroskopie ermöglicht eine sehr schnelle Aufnahme hochauflösender Bilder. Der optische Anregungsweg verläuft durch die sogenannte rotierende Scheibe, die eine große Anzahl von „Pinholes“ enthält, welche die Konfokalität des aufgenommenen Bildes gewährleisten (Abbildung 3). Bereits bei einer Drehung der Scheibe um wenige Grad wird das gesamte Sichtfeld abgedeckt (die Drehzahlen liegen bei etwa 6000 Umdrehungen pro Minute – Dragonfly). Ein weiterer Vorteil der konfokalen Mikroskopie auf Basis einer rotierenden Scheibe ist der Einsatz empfindlicher und sehr schneller Kameras mit hohem Dynamikbereich zur Bilderfassung (Zyla/iXon).
Die wichtigsten Vorteile der Spinning-Disc-Technik
- Hohe Bildaufnahmegeschwindigkeit (Hunderte bis Tausende von Bildern pro Sekunde)
- Hohe Empfindlichkeit (Quantenausbeute der Kameras bis zu 95 %)
- Geringe Phototoxizität
- Reduziertes Photobleaching
Quelle: „Spinning Disk Confocal – A Technical Overview...“ Abgerufen am 25. November 2016 www.andor.com/learning-academy/spinning-disk-confocal-a-technical-overview
