Die Live-Cell-Imaging-Technik ist eine sehr beliebte Methode in der Zellbiologie. Die Gewinnung korrekter und qualitativ hochwertiger Informationen hängt von mehreren spezifischen Faktoren ab, die Experimente mit lebenden Zellen erheblich beeinflussen können. Für das Live-Cell-Imaging empfehlen wirein konfokales Mikroskop auf Basis einer rotierenden Scheibe – ein SDCM (Spinning-Disc-Konfokalmikroskop) – oder ein Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop mit Dekonvolutionssoftware.
Bei der Beobachtung lebender Zellen (Live-Cell-Imaging) muss großer Wert auf die Reduzierung phototoxischer Effekte des Lichts (Bleaching) gelegt werden. Die für die untersuchten Zellen verträgliche Beleuchtungsleistungsdichte auf der Probenebene liegt im Bereich vonmW/cm² (Weitfeld-Fluoreszenzmikroskope) bisW/cm² ( SDCM – Spinning-Disc-Konfokalmikroskope). Bei hoher Beleuchtungsleistungsdichte kommt es zu einem intensiven Bleaching der Fluorophore, wodurch freie Radikale und andere Reaktionsprodukte entstehen, die Moleküle in der Umgebung zerstören und das Milieu außerhalb und innerhalb der Zellen verändern.
Zellkulturen und Gewebe müssen während der gesamten Dauer des Experiments unter physiologischen Bedingungen gehalten werden. Faktoren wie Temperatur, Feuchtigkeit, Zusammensetzung des Mediums und pH-Wert sind sehr wichtig, um aussagekräftige Informationen über die untersuchten Prozesse zu erhalten. Je nach Herkunft der kultivierten Zellen müssen die oben genannten Faktoren auf bestimmte Werte eingestellt und diese Werte stabil gehalten werden.
Mitochondrien in Gliomzellen. iXon Ultra, 60-fache Vergrößerung, NA: 1,49. Insgesamt wurden6.478 Bilder mit 1 Mpx aufgenommen! Voxel 0,201 × 0,201 × 0,293 µm,X/Y: 1024 × 1024 Pixel,Z: 41,T: 79, 2 Kanäle. Die Daten wurden während eines kurzen (13 min) Zeitraffer-Experiments im Rahmen einer Vorführung des Andor Dragonfly-Systems aufgenommen. Die Proben wurden von Dr. Veronika Huntošová von der UPJS/CIB, Košice, Slowakei, zur Verfügung gestellt.
Die wesentliche Ausstattung für das Live-Cell-Imaging- Mikroskop ist in der Tabelle aufgeführt:
| Ausstattung | Vorteil | Grund | Hersteller |
|---|---|---|---|
| Konfokalmikroskop (SDCM) |
Geringe Ausbleichung Hohe Bildaufnahmegeschwindigkeit |
Scheibe mit Pinhole-Set gewährleistet die Konfokalität Gleichzeitige Ausleuchtung des gesamten Sichtfelds Einsatz von Kameras zur Erfassung des Emissionssignals |
Andor |
| Dekonvolution |
3D-Rekonstruktion von Bildern aus einem Widefield-Fluoreszenzmikroskop Höhere Auflösung |
Algorithmen zur Entfernung von Signalen aus dem Unschärfebereich Neuordnung des Signals entsprechend den Parametern des verwendeten Mikroskops |
Bitplane |
| Kameras |
Hohe Empfindlichkeit Hohe Geschwindigkeit Hohe Auflösung |
Ausgefeilte Sensorarchitektur (sCMOS/EMCCD) Schnelle Signalauslesung |
Andor |
| Inkubator | Regelung von Temperatur, Feuchte und pH-Wert | Isolierung der Probe von der Umgebung und präzise Regelung der Bedingungen während des Experiments | Okolab |
| Motorisierter Tisch |
Hohe Auflösung Wiederholbarkeit |
Präzisionskomponenten Piezo-Motoren für maximale Auflösung |
PI |
| Visualisierung und Analyse |
3D-Visualisierung Analyse der gewonnenen Informationen Vergleich der Ergebnisse |
Kolokalisierung (2D/3D-Kolokalisierung) Verfolgung (2D/3D-Tracking) Gewinnung statistischer Daten Erstellung von Diagrammen |
Bitplane |
Das Konfokalmikroskop Andor Dragonflyerfüllt alle Voraussetzungen für die Live-Zell-Bildgebung (Live Cell Imaging):
Aufnahmegeschwindigkeit
- 400 Bilder pro Sekunde (512 × 512 Pixel)
- Minimale Belichtungszeit – 2,5 ms
Empfindlichkeit
- 90 % Quanteneffizienz bei iXon-Kameras (EMCCD)
- 82 % Quanteneffizienz bei Zyla-Kameras (sCMOS)
Umgebungskontrolle
- Inkubatoren von weltweit führenden Herstellern (Okolab)
Mikroskop
- Präziser piezoelektrisch angetriebener XY- und Z-Tisch
- Autofokus-Hardware
- Spezialobjektive
Sonstiges
- Active Blanking – Verbindung zwischen Lichtquelle und Kameras
- Filter – kompatibel mit den erforderlichen Wellenlängen im Anregungs- und Emissionsweg
