RM5 konfokální Ramanův mikroskop

Excitační laserový paprsek jednoho ze tří integrovaných laserů (1) je prostřednictvím série motorizovaných zrcadel s piezoelektrickým posuvem veden přímo na pohyblivý XYZ mikroskopický stolek (3), kde je objektivem fokusován na umístěný vzorek. Vzorek lze sledovat v reálném čase pomocí vestavěné CMOS kamery (4). Tím samým objektivem je následně sbíráno vzniklé rozptýlené světlo ze vzorku a pomocí filtru je odstraněno nežádoucí rozptýlené světlo z oblasti mimo oblast fokusace laserového paprsku. Prošlé Ramanovo rozptýlené světlo prostupuje ještě před vstupem do spektrografu přes nastavitelnou konfokální pinhole (5). Poté je světlo rozděleno, díky jedné z 5ti difrakčních mřížek umístěných v plně motorizovaném karuselu, do svých základních vlnových délek (6), které jsou fokusovány do detektoru/detektorů (7) a zobrazeny jako spektrum. Veškeré vnitřní standardy (2) týkající se kalibrace vlnové délky, Ramanova posuvu, citlivosti a automatizovaného nastavení pozice laserového svazku jsou součástí ovládacího softwaru Ramacle®.

Lasery

Součástí mikroskopu jsou integrované až tři úzkopásmové lasery o vlnových délkách 532 nm, 638 nm, 785 nm (k dispozici jsou však všechny vlnové délky od 400 nm do 1064 nm), jejichž výběr a nastavení intenzity laserového svazku je plně ovládáno v softwaru. Díky možnosti výběru vhodné excitační vlnové délky, její optimalizaci pro dané aplikace a přítomnosti konfokální pinhole je zajištěno potlačení signálů na pozadí, které mohou být způsobeny fluorescencí při analýze biologických vzorků. Automatizované nastavení pozice laserového svazku (laser alignment) a kalibrace vlnové délky je jedním z vnitřních standardů, které jsou do RM5 mikroskopu integrovány již při výrobě.

Optika

Hlavní optický prvek RM5 mikroskopu představuje plně automatizovaný karusel s celkem 4 pozicemi pro tři dichroické filtry (hranové a notch) a jeden dělič paprsků (beam splitter) a nastavitelná konfokální pinhole. Výměna a výběr filtrů, nastavení pozice beam splitteru a velikosti pinhole je umožněno v ovládacím software. Automatický alignment přístroje je zajištěn pomocí dvou zabudovaných zrcátek s piezoelektrickým posuvem. Volitelným příslušenstvím pro pokročilou polarizační analýzu Ramanových spekter je přídavný polarizátor a analyzátor umožňující studium symetrie vibračních módů, orientace jednotlivých krystalů, polykrystalických vzorků a anizotropních materiálů.

Spektrograf

Součástí systému je spektrograf s osvědčeným designem typu Czerny-Turner a ohniskovou vzdáleností 255 mm sestávající z plynule nastavitelné štěrbiny a karuselu na difrakční mřížky s 5 pozicemi pro pokrytí co nejširšího spektrálního rozsahu (až 4000 cm^-1). Veškeré kalibrační standardy jsou při výrobě implementovány přímo do ovládacího software. Jedná se především o tyto vnitřní standardy:

• Kalibrace vlnové délky (Neon standard),
• Kalibrace Ramanova posuvu (Si standard),
• Ověření citlivosti (Si standard),
• Automatizované nastavení pozice laserového svazku

Detektory

Součástí RM5 mikroskopu je integrovaný, vysoce citlivý CCD detektor pro ultra nízké hladiny šumu, s termoelektrickým chlazením až na -60 °C a rozlišením 1650 x 200 pixelů nebo 2000 x 256 pixelů (pro zvýšenou citlivost a spektrální rozsah). Pro vyšší rychlost, citlivost a zvýšení rychlosti vzorkování je k dispozici druhý port pro integraci přídavného detektoru s komplementárním spektrálním pokrytím – EMCCD nebo InGaAs. RM5 zajišťuje díky kombinaci vysoce citlivých a rychlých detektorů optimální výkon a poskytuje výjimečnou rychlost sběru dat - kompletní spektrum lze zaznamenat během 0.001 sekundy.

Důkazem maximální citlivosti je detekce čtvrtého řádu pásu křemíku při 1940 cm^-1 (viz. spektrum křemíku po excitaci 785 nm laserem).

Vysoce výkonný mikroskop

Nejnovější generace vzpřímeného mikroskopu Olympus série BX53, který je součástí RM5 systému, umožňuje využívat veškerých pokročilých vizualizačních a kontrastních technik pro zobrazení vzorku, kterými jsou brightfield, darkfield, polarizované světlo, Normanského diferenciální interferenční kontrast (DIC) a fluorescence. Manuální XY nebo plně motorizovaný XYZ mikroskopický stolek poskytuje možnost lokalizace a Ramanovského mapování daných oblastí zájmu na zkoumaném vzorku. Volitelným doplňkem je možnost vyhřívání/chlazení stolku. Mikroskop je standardně vybaven 10x a 100x objektivy, zásobník však lze osadit až 5 objektivy.

Software

Pro kompletní ovládání celého systému, sběr spektrálních dat, jejich zobrazení a analýzu je k dispozici uživatelsky přívětivý software Ramacle®. Tento software umožňuje vizualizaci vzorku, monitorování „živých signálů“, zisk liniových skenů, rovinných map, objemových map, optimalizaci parametrů před každým měřením a mnoho dalšího. Nastavitelné konfokální uspořádání RM5 mikroskopu umožňuje vysoké prostorové rozlišení ve všech třech směrech.

Klíčové vlastnosti softwaru Ramacle®:

• Výběr laserových a rozptylových optických drah
• Výběr excitační vlnové délky, difrakčních mřížek a expoziční doby
• Vizualizace vzorku a laserového zaostření
• Programovatelný atenuátor a závěrka
• Akvizice jednoduchých, akumulovaných a kinetických spekter
• Spektrální korekce
• Výběr vnitřních kalibračních standardů a automatizovaná korekce kalibrací
• Operace s daty jako je aritmetika, škálování, normalizace a odečítání základní hodnoty (baseline substraction)
• Odstranění kosmického záření, oříznutí, vyhlazení
• Automatizované nastavení pozice laserového svazku
• Funkce importu/exportu dat ASCII / CSV
• Možnosti prezentací a publikací
• Funkce mapování – nastavení map, sběr dat a jejich analýza
• Plně motorizovaný XYZ stolek – ovládání pomocí joysticku a v softwaru
• Výběr a ovládání polarizátoru a analyzátoru (pro pokročilou polarizační analýzu Ramanových spekter)
• Výběr detektorů, filtrů, externí kamery
• Volitelným doplňkem je modul pro chemometrickou analýzu a balíček knihovny spekter KnowItAllTM

Více informací naleznete v přiloženém datovém listu.