RM5 confocal Raman microscope

The excitation laser beam from one of the three integrated lasers (1) is guided directly onto a movable XYZ microscope stage ( 3) via a series of motorized mirrors with piezoelectric displacement, where it is focused onto the sample by an objective lens. The sample can be monitored in real time using a built-in CMOS camera (4). The same lens is then used to collect the stray light generated from the sample and a filter is used to remove unwanted stray light from the area outside the laser beam focusing area. The transmitted Raman scattered light passes through an adjustable confocal pinhole (5) before entering the spectrograph. The light is then split, by one of the 5 diffraction gratings located in the fully motorized carousel, into its fundamental wavelengths (6), which are focused into the detector/detectors (7) and displayed as a spectrum. All internal standards (2) regarding wavelength calibration, Raman shift, sensitivity and automated laser beam positioning are included in the Ramacle® control software.

Lasery

Součástí mikroskopu jsou integrované až tři úzkopásmové lasery o vlnových délkách 532 nm, 638 nm, 785 nm (k dispozici jsou však všechny vlnové délky od 400 nm do 1064 nm), jejichž výběr a nastavení intenzity laserového svazku je plně ovládáno v softwaru. Díky možnosti výběru vhodné excitační vlnové délky, její optimalizaci pro dané aplikace a přítomnosti konfokální pinhole je zajištěno potlačení signálů na pozadí, které mohou být způsobeny fluorescencí při analýze biologických vzorků. Automatizované nastavení pozice laserového svazku (laser alignment) a kalibrace vlnové délky je jedním z vnitřních standardů, které jsou do RM5 mikroskopu integrovány již při výrobě.

Optika

Hlavní optický prvek RM5 mikroskopu představuje plně automatizovaný karusel s celkem 4 pozicemi pro tři dichroické filtry (hranové a notch) a jeden dělič paprsků (beam splitter) a nastavitelná konfokální pinhole. Výměna a výběr filtrů, nastavení pozice beam splitteru a velikosti pinhole je umožněno v ovládacím software. Automatický alignment přístroje je zajištěn pomocí dvou zabudovaných zrcátek s piezoelektrickým posuvem. Volitelným příslušenstvím pro pokročilou polarizační analýzu Ramanových spekter je přídavný polarizátor a analyzátor umožňující studium symetrie vibračních módů, orientace jednotlivých krystalů, polykrystalických vzorků a anizotropních materiálů.

Spektrograf

Součástí systému je spektrograf s osvědčeným designem typu Czerny-Turner a ohniskovou vzdáleností 255 mm sestávající z plynule nastavitelné štěrbiny a karuselu na difrakční mřížky s 5 pozicemi pro pokrytí co nejširšího spektrálního rozsahu (až 4000 cm^-1). Veškeré kalibrační standardy jsou při výrobě implementovány přímo do ovládacího software. Jedná se především o tyto vnitřní standardy:

• Kalibrace vlnové délky (Neon standard),
• Kalibrace Ramanova posuvu (Si standard),
• Ověření citlivosti (Si standard),
• Automatizované nastavení pozice laserového svazku

Detektory

Součástí RM5 mikroskopu je integrovaný, vysoce citlivý CCD detektor pro ultra nízké hladiny šumu, s termoelektrickým chlazením až na -60 °C a rozlišením 1650 x 200 pixelů nebo 2000 x 256 pixelů (pro zvýšenou citlivost a spektrální rozsah). Pro vyšší rychlost, citlivost a zvýšení rychlosti vzorkování je k dispozici druhý port pro integraci přídavného detektoru s komplementárním spektrálním pokrytím – EMCCD nebo InGaAs. RM5 zajišťuje díky kombinaci vysoce citlivých a rychlých detektorů optimální výkon a poskytuje výjimečnou rychlost sběru dat - kompletní spektrum lze zaznamenat během 0.001 sekundy.

Důkazem maximální citlivosti je detekce čtvrtého řádu pásu křemíku při 1940 cm^-1 (viz. spektrum křemíku po excitaci 785 nm laserem).

Vysoce výkonný mikroskop

Nejnovější generace vzpřímeného mikroskopu Olympus série BX53, který je součástí RM5 systému, umožňuje využívat veškerých pokročilých vizualizačních a kontrastních technik pro zobrazení vzorku, kterými jsou brightfield, darkfield, polarizované světlo, Normanského diferenciální interferenční kontrast (DIC) a fluorescence. Manuální XY nebo plně motorizovaný XYZ mikroskopický stolek poskytuje možnost lokalizace a Ramanovského mapování daných oblastí zájmu na zkoumaném vzorku. Volitelným doplňkem je možnost vyhřívání/chlazení stolku. Mikroskop je standardně vybaven 10x a 100x objektivy, zásobník však lze osadit až 5 objektivy.

Software

Pro kompletní ovládání celého systému, sběr spektrálních dat, jejich zobrazení a analýzu je k dispozici uživatelsky přívětivý software Ramacle®. Tento software umožňuje vizualizaci vzorku, monitorování „živých signálů“, zisk liniových skenů, rovinných map, objemových map, optimalizaci parametrů před každým měřením a mnoho dalšího. Nastavitelné konfokální uspořádání RM5 mikroskopu umožňuje vysoké prostorové rozlišení ve všech třech směrech.

Klíčové vlastnosti softwaru Ramacle®:

• Výběr laserových a rozptylových optických drah
• Výběr excitační vlnové délky, difrakčních mřížek a expoziční doby
• Vizualizace vzorku a laserového zaostření
• Programovatelný atenuátor a závěrka
• Akvizice jednoduchých, akumulovaných a kinetických spekter
• Spektrální korekce
• Výběr vnitřních kalibračních standardů a automatizovaná korekce kalibrací
• Operace s daty jako je aritmetika, škálování, normalizace a odečítání základní hodnoty (baseline substraction)
• Odstranění kosmického záření, oříznutí, vyhlazení
• Automatizované nastavení pozice laserového svazku
• Funkce importu/exportu dat ASCII / CSV
• Možnosti prezentací a publikací
• Funkce mapování – nastavení map, sběr dat a jejich analýza
• Plně motorizovaný XYZ stolek – ovládání pomocí joysticku a v softwaru
• Výběr a ovládání polarizátoru a analyzátoru (pro pokročilou polarizační analýzu Ramanových spekter)
• Výběr detektorů, filtrů, externí kamery
• Volitelným doplňkem je modul pro chemometrickou analýzu a balíček knihovny spekter KnowItAllTM

Více informací naleznete v přiloženém datovém listu.